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    克洛諾菌Cronobacter 原名阪崎腸桿菌Enterobacter sakazakii，是一種革蘭氏陰性桿菌，能引起嬰兒與早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結(jié)TM 腸炎。是嬰幼兒配方食品的必檢項(xiàng)目。Brilliance 阪崎腸桿菌顯色瓊脂（DFI）已寫(xiě)入食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.40-2008。阪崎腸桿菌在DFI瓊脂上呈現(xiàn)鮮艷的藍(lán)綠色菌落，透明的培養(yǎng)基底色，清晰易辨。增菌肉湯含有萬(wàn)古霉素和高濃度的鹽離子，強(qiáng)效抑制非目標(biāo)菌。我們提供檢測(cè)阪崎腸桿菌的完整解決方案。

Brilliance阪崎腸桿菌顯色瓊脂（DFI）

用于分離和鑒別食品和乳品中的阪崎腸桿菌屬（現(xiàn)稱(chēng)為克洛諾菌）的顯色培養(yǎng)基，符合Druggan，F(xiàn)orsythe and Iverson的配方。

Brilliance^TM阪崎腸桿菌顯色瓊脂（DFI配方）：

配方表：

* 可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)需要自行調(diào)整配方

使用方法：

稱(chēng)取43.1g的CM1055到1L蒸餾水中，混勻加熱沸騰至完全溶解，121℃滅菌15分鐘，冷卻至50℃，混勻倒平板。

產(chǎn)品描述：

Brilliance阪崎腸桿菌顯色瓊脂（DFI）是基于α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)原理，通過(guò)與培養(yǎng)基中的顯色劑 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D吡喃葡萄糖苷的結(jié)合來(lái)檢測(cè)出來(lái)。存在于阪崎腸桿菌內(nèi)的α-葡萄糖苷酶水解顯色劑底物，在黃色平板上產(chǎn)生藍(lán)綠色菌落。普通變形桿菌也是α-葡萄糖苷酶弱陽(yáng)性的菌株，也可以產(chǎn)生與阪崎腸桿菌相似的菌落，但是在這種培養(yǎng)基上，變形桿菌屬會(huì)長(zhǎng)成灰色菌落：當(dāng)培養(yǎng)基里面的鐵離子形成硫鐵化物時(shí)能生產(chǎn)硫氫化物。而脫氧膽酸鹽可以抑制大部分革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。

阪崎腸桿菌是一種革蘭氏陰性的棒狀細(xì)菌，很少能引起成人的疾病，不過(guò)它與早產(chǎn)兒（新生兒）的疾病產(chǎn)生有關(guān)。研究表明，新生兒或由其他醫(yī)學(xué)問(wèn)題的嬰兒更容易感染阪崎腸桿菌。大部分報(bào)告的病例都是嚴(yán)重的，包括敗血癥（血液中的細(xì)菌），腦膜炎，或壞死性小腸結(jié)腸炎（嚴(yán)重的腸道感染）。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的損害可能是永久性的，且死亡率據(jù)報(bào)道高達(dá)40-80%。 

阪崎腸桿菌是一種機(jī)會(huì)主義的病原菌，從少數(shù)嬰兒奶粉中分離出來(lái)。這種有機(jī)物的高收縮性給阪崎腸桿菌在干燥環(huán)境中提供了更佳的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，當(dāng)在奶粉廠中被發(fā)現(xiàn)時(shí)，從而會(huì)提高經(jīng)過(guò)巴氏消毒后成品的感染風(fēng)險(xiǎn)。

最近的檢測(cè)阪崎腸桿菌的FDA方法是基于黃色色素的生產(chǎn)，源于Muytjens等人開(kāi)創(chuàng)的方法，樣品在水中過(guò)夜培養(yǎng)，然后在EE肉湯（CM0317）中增菌，再用VRBGA平板（CM0485）分離阪崎腸桿菌，挑取5個(gè)菌落接種到胰蛋白胨大豆瓊脂（CM0131）上，培養(yǎng)最多三天，檢測(cè)黃色菌落，典型的阪崎腸桿菌。但是這種方法不是阪崎腸桿菌的選擇性培養(yǎng)方法，EE肉湯和VRGBA會(huì)使其他腸桿菌過(guò)度生長(zhǎng)而壓制阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的陰性結(jié)果。要在VRBGA平板上根據(jù)菌落形態(tài)分離出阪崎腸桿菌不太可能，因?yàn)樗c其他腸桿菌的菌落形態(tài)相似。

技術(shù)要點(diǎn)：

請(qǐng)注意以下方法是唯一的建議使用方法：

Oxoid阪崎腸桿菌顯色瓊脂可以提高嬰兒奶粉和其他食品中阪崎腸桿菌的恢復(fù)率，可以替代FDA方法2002中的2種培養(yǎng)基。

1、使用接種環(huán)將培養(yǎng)過(guò)的EE肉湯接種到阪崎腸桿菌顯色瓊脂平板上；

2、將平板在35-37℃下培養(yǎng)基24小時(shí)，查看藍(lán)綠色菌落；

3、對(duì)藍(lán)綠色的可以菌落確認(rèn)為阪崎腸桿菌，根據(jù)其生物化學(xué)特性，比如通過(guò)一些檢測(cè)系統(tǒng)，例如Microbact 24E 產(chǎn)品，貨號(hào)MB1131A或MB1074A。

質(zhì)控：

陽(yáng)性對(duì)照：Enterobacter sakazakii ATCC?29004    生長(zhǎng)良好，藍(lán)綠色菌落；

               Escherichia coli  ATCC?25922         生長(zhǎng)良好，稻草色菌落；

陰性對(duì)照：Staphylococcus aureus  ATCC?25923    抑制生長(zhǎng)。

克洛諾菌篩選肉湯和克洛諾菌顯色分離瓊脂

篩選肉湯Cronobacter Screening Broth (CSB)是選擇性增菌肉湯，與顯色瓊脂CM1122聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)食品中克洛諾菌（以前叫阪崎腸桿菌）的分離和計(jì)數(shù)。

克洛諾菌篩選肉湯基礎(chǔ) CM1121：

成分表：

*可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)需要調(diào)整

克洛諾菌顯色分離瓊脂 CM1122

成分表：

*可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)需要調(diào)整

產(chǎn)品描述

隨著新水平的CEN-ISO方法中關(guān)于克洛諾菌檢測(cè)方法的不斷發(fā)展，在ISO/TC 34, SC 9Ad hoc group中，解決的問(wèn)題有檢測(cè)方法的范圍，鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)基的改進(jìn)。為適應(yīng)這些新的需要，Oxoid研發(fā)出來(lái)新的克洛諾菌篩選肉湯CM1121和顯色分離瓊脂CM1122。

克洛諾菌篩選肉湯（CSB）是由Iversen等人發(fā)明的，配合顯色瓊脂的使用。它能在進(jìn)行選擇性瓊脂培養(yǎng)之前來(lái)預(yù)判斷克洛諾菌陽(yáng)性的樣品，它也時(shí)克洛諾菌陰性的樣品比其他方法中至少少培養(yǎng)了24小時(shí)。這些功能通過(guò)蔗糖和pH指示劑溴甲酚紫的加入而實(shí)現(xiàn)，克洛諾菌可以發(fā)酵蔗糖，在顯色瓊脂上表現(xiàn)為假陽(yáng)性的大部分其他腸桿菌則不能發(fā)酵蔗糖，然后如果在培養(yǎng)后肉湯中出現(xiàn)黃色或橘黃色（發(fā)酵蔗糖的結(jié)果），說(shuō)明可以預(yù)判斷含克洛諾菌，如果培養(yǎng)后肉湯是紫色的，可以斷定樣品中沒(méi)有克洛諾菌。

克洛諾菌顯色分離平板（CCI）最早由艾弗森等人于2004年開(kāi)發(fā)優(yōu)化。X-α-葡萄糖苷濃度的增加會(huì)增強(qiáng)弱葡糖苷酶的活性，使顏色反應(yīng)更明顯。硫代硫酸鈉和檸檬酸鐵銨則可以把產(chǎn)硫化氫的腸桿菌區(qū)分出來(lái)，它們產(chǎn)生灰色/棕色菌落，而去氧膽酸鈉抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。

技術(shù)要點(diǎn)

1、 根據(jù) ISO 68874, ISO 82615 及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制備樣品
2、 將X g樣品等量分裝與X ml的9倍體積的ISO緩沖蛋白胨溶液（如CM1049）中。
3、 37℃±1℃培養(yǎng)18h±2h
4、 取0.1ml培養(yǎng)液至10ml的CSB培養(yǎng)基中， 41.5°C ± 1°C培養(yǎng)24h ± 2h
5、 如果肉湯呈現(xiàn)紫色，則結(jié)果為陰性，不需要繼續(xù)。如果呈現(xiàn)黃色，則繼續(xù)第6個(gè)步驟
6、 取10μl培養(yǎng)液涂布與CCI瓊脂平板上
7、 44°C ± 1°C倒置培養(yǎng)24h ± 2h
8、 挑取1-5個(gè)菌落進(jìn)行鑒定
9、 接種到胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基， 37°C ± 1°C培養(yǎng)18h ± 2h
10、進(jìn)行必要的生化檢測(cè)

mLST/萬(wàn)古霉素肉湯和阪崎腸桿菌分離瓊脂

用于牛奶和乳制品中克洛諾菌（以前稱(chēng)阪崎腸桿菌）的選擇性增菌（使用CM1133和SR0247E），預(yù)計(jì)分離和計(jì)數(shù)（使用CM1134），配方符合ISO/TS22964:2006

改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨萬(wàn)古霉素肉湯 CM1133

配方表：

*可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)需要調(diào)整

阪崎腸桿菌分離瓊脂 CM1134

配方表：

*可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)需要調(diào)整

產(chǎn)品描述

為了對(duì)應(yīng)阪崎腸桿菌的感染問(wèn)題，由ISO和IDF聯(lián)合發(fā)布牛奶和奶制品中阪崎腸桿菌檢測(cè)方法，并制定了ISO/TS22964:20063。通過(guò)BPW預(yù)增菌，再用mLST萬(wàn)古霉素肉湯選擇性增菌，以及阪崎腸桿菌分離瓊脂。利用糖利用、脫羧酶活性以及黃色素沉著等特性來(lái)確定陽(yáng)性克隆。

mLST萬(wàn)古霉素肉湯CM1133中的高鹽濃度限值了其他腸桿菌的生長(zhǎng)，萬(wàn)古霉素和月桂基硫酸鈉抑制了樣品中革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)， 蛋白胨和乳糖的合適用量使得樣品中的克洛諾菌在這些抑制劑的存在下仍然能生長(zhǎng)。

與其它腸桿菌不同，阪崎腸桿菌具有α-糖苷酶，以此來(lái)指示培養(yǎng)基的顯色。阪崎腸桿菌分離瓊脂中含有5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基α-D-吡喃葡糖苷。Cronobacter能水解顯色劑，產(chǎn)生藍(lán)色/綠色菌落。脫氧膽酸鈉和結(jié)晶紫能夠抑制培養(yǎng)基中革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。

歐盟已嚴(yán)格規(guī)定在嬰兒配方奶粉、特殊醫(yī)療營(yíng)養(yǎng)品以及半歲嬰兒食品中阪崎腸桿菌的含量，并已立法。此規(guī)定規(guī)定市場(chǎng)中的產(chǎn)品，在保質(zhì)期內(nèi)，生產(chǎn)商必須保證抽查的樣品按照ISO/TS 22964:20063中規(guī)定的方法檢測(cè)不含阪崎腸桿菌。

技術(shù)要點(diǎn)

請(qǐng)參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法的詳細(xì)說(shuō)明，一下方法是ISO/TS 22964:20063的部分摘要
1、 根據(jù)ISO 68875, ISO 82616或者相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備測(cè)試樣品。
2、 將Xg樣品等量分裝與9Xml緩沖蛋白水溶液ISO（CM1049）中。
3、 37℃±1℃培養(yǎng)18h±2h
4、 取0.1ml富集液加入10mlMLST/萬(wàn)古霉素肉湯（CM1133&SRO247）中。
5、 44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h
6、 取10μl溶液接種到阪崎腸桿菌的分離瓊脂平板上（CM1134），倒置培養(yǎng)，44℃±1℃，24h±2h
7、 選取1-5個(gè)藍(lán)色/綠色菌落
8、 將菌落接種到胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，37℃±1℃18h-24h培養(yǎng)，觀察是否有黃色沉淀
9、 進(jìn)行必要的生化試驗(yàn)確認(rèn)

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